如何培養(yǎng)原代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞？

　　小鼠骨髓基質(zhì)系統(tǒng)內(nèi)存在的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種除造血干細(xì)胞以外的、具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經(jīng)等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細(xì)胞。那么它是如何培育的呢？

　　
 

　　1、材料

　　

　　成年小鼠4只、胎牛血清、L-DMEM、胰蛋白酶、PBS、Percool細(xì)胞分離液、雙抗、8%碳酸氫鈉溶液。

　　

　　2、儀器

　　

　　倒置顯微鏡、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、生物顯微鏡、低溫高速離心機(jī)、無(wú)菌操作臺(tái)、血球計(jì)數(shù)板、6孔培養(yǎng)板。

　　

　　3、方法

　　

　　骨髓收集→Percoll密度梯度離心法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞→貼壁培養(yǎng)→形態(tài)學(xué)觀察→原代培養(yǎng)細(xì)胞

　　

　　注：原代培養(yǎng)時(shí)胎牛血清比例可適當(dāng)提升，可以提高細(xì)胞成活率。

　　

　　4、結(jié)果

　　

　　（1）骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

　　

　　24h后就見(jiàn)有細(xì)胞貼壁，多數(shù)細(xì)胞呈圓形。72h后半量換液去除未貼壁細(xì)胞，此時(shí)貼壁的細(xì)胞為單個(gè)，形態(tài)大部分為圓形。第一次換液后5~7天可見(jiàn)由幾十個(gè)到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的集落，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、三角形、星形。原代培養(yǎng)10天左右，細(xì)胞快速增殖，每個(gè)集落中的細(xì)胞不斷增殖呈長(zhǎng)梭形放射狀排列。培養(yǎng)2周左右，每個(gè)小集落形成約數(shù)百至上千個(gè)細(xì)胞的大集落，集落交界處出現(xiàn)重疊、融合。

　　

　　（2）骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

　　

　　生長(zhǎng)曲線表明BMSCs的增殖能力很強(qiáng)，所測(cè)細(xì)胞在開始的前4天里生長(zhǎng)緩慢處于潛伏適應(yīng)期，第5天開始迅速增長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到第9天細(xì)胞數(shù)輕度上升，第10天達(dá)到頂點(diǎn)，生長(zhǎng)速度減緩進(jìn)入平臺(tái)期。